RNA oni-meji (dsRNA) ELISA KIT

Ohun elo yii jẹ Imudara Immunosorbent Assay (ELISA) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) pẹlu eto biotin-Streptavidin, fun wiwọn pipo ti dsRNA pẹlu ipari ju awọn orisii ipilẹ 60 (bp), laibikita ọna ti o tẹle.A ti bo awo naa pẹlu egboogi-dsRNA antibody.dsRNA ti o wa ninu ayẹwo ni a ṣafikun ati sopọ mọ awọn apo-ara ti a bo lori awọn kanga.Ati lẹhinna biotinylated anti-dsRNA antibody ti wa ni afikun ati sopọ mọ dsRNA ninu apẹẹrẹ.Lẹhin fifọ, HRP-Streptavidin ti wa ni afikun o si so mọ anti-dsRNA antibody Biotinylated.Lẹhin ti abeabo unbound HRP-Streptavidin ti wa ni fo kuro.Lẹhinna ojutu sobusitireti TMB jẹ afikun ati ki o ṣe itọsi nipasẹ HRP lati ṣe agbejade ọja awọ bulu kan ti o yipada si ofeefee lẹhin fifi ojutu iduro ekikan kun.Awọn iwuwo ti ofeefee ni iwon si awọn afojusun iye ti dsRNA sile ninu awo.Iwọn gbigba jẹ iwọn 450 nm.

Ohun elo

Ohun elo yii wa fun wiwọn pipo ti dsRNA ti o ku.

Awọn paati ohun elo

Ibi ipamọ ati Iduroṣinṣin

1. Fun ohun elo ti ko lo: Gbogbo ohun elo le wa ni ipamọ ni 2 ~ 8 ℃ ni igbesi aye selifu.Imọlẹ to lagbara yẹ ki o yago fun iduroṣinṣin ipamọ.

2. Fun ohun elo ti a lo: Ni kete ti a ti ṣii microplate, jọwọ bo awọn kanga ti a ko lo pẹlu olutọpa awo ati ki o pada si apo apamọwọ ti o ni idii desiccant, zip-seal the foil apo ati pada si 2 ~ 8℃ ni kete bi o ti ṣee lẹhin lilo.Awọn reagents miiran yẹ ki o pada si 2 ~ 8 ℃ ni kete bi o ti ṣee lẹhin lilo.

Awọn ohun elo ti a beere Ṣugbọn Ko Pese

1. Microplate RSS pẹlu 450 ± 10nm àlẹmọ (dara ti o ba le ri ni 450 ati 650 nm wefulenti).

2. Microplate gbigbọn.

3. RNase-free awọn italolobo ati centrifuge Falopiani.

Aworan sisan iṣẹ

Ṣaaju ki O Bẹrẹ

1. Mu gbogbo awọn paati ohun elo ati awọn ayẹwo si iwọn otutu yara (18-25 ℃) ṣaaju lilo.Ti ohun elo naa ko ba ni lo ni akoko kan, jọwọ mu awọn ila ati awọn reagents jade fun idanwo lọwọlọwọ, ki o fi awọn ila to ku ati awọn reagents silẹ ni ipo ti o nilo.

2. Fifọ ifasilẹ: dilute 40mL of 20× ogidi fifọ ifipamọ pẹlu 760mL ti deionized tabi distilled omi lati mura 800mL ti 1× fifọ saarin.

3. Standard: ni soki yiyi tabi centrifuge iṣura ojutu ṣaaju lilo.Ifojusi ti awọn iṣedede mẹrin ti a pese jẹ 5ng/μL.Fun UTP ati awọn iṣedede pUTP dsRNA, jọwọ di ojutu ọja iṣura si 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL pẹlu ifipamọ STE lati fa ọna iwọn.Fun awọn iṣedede N1-Me-pUTP dsRNA, jọwọ di ojutu ọja iṣura si 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL pẹlu STE ifipamọ lati fa iwọn ti tẹ.Fun apewọn 5-OMe-UTP dsRNA, jọwọ di ojutu ọja iṣura si 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL pẹlu ifipamọ STE lati fa ọna kika boṣewa.A ṣeduro awọn iṣedede le ti fomi bi awọn shatti wọnyi:

4. Antibody erin Biotinylated ati HRP-streptavidin ojutu ṣiṣẹ: yiyi ṣoki tabi centrifuge ojutu ọja ṣaaju lilo.Di wọn pọ si ifọkansi iṣẹ pẹlu ifipamọ dilution.

5. TMB substate: aspirate awọn ti nilo doseji ti ojutu pẹlu sterilized awọn italolobo ati ki o ma ko WASTE awọn iyokù ojutu sinu vial lẹẹkansi.Ipinlẹ TMB jẹ ifarabalẹ si ina, maṣe fi sobusitireti TMB han si imọlẹ fun igba pipẹ.

Lilo Ilana

1. Ṣe ipinnu nọmba awọn ila ti o nilo fun ayẹwo.Fi awọn ila sinu awọn fireemu fun lilo.Awọn ila awo ti o ku ti a ko lo ninu ayẹwo yii yẹ ki o tun ṣe sinu apo pẹlu desiccant.Pa apo naa ni wiwọ fun ibi ipamọ ti o tutu.

2. Fi 100μL kọọkan ti awọn dilutions ti boṣewa, òfo ati awọn ayẹwo sinu awọn kanga ti o yẹ.Bo pẹlu sealer awo.Incubate fun 1hr ni yara otutu pẹlu gbigbọn ni 500rpm.Awọn ayẹwo yẹ ki o ti fomi po pẹlu ifipamọ STE si ifọkansi ti o yẹ fun iṣiro deede.

3. Igbesẹ fifọ: Aspirate ojutu naa ki o si wẹ pẹlu 250μL fifọ fifọ si daradara kọọkan ki o jẹ ki o duro fun 30s.Jabọ ififoju ifọṣọ patapata nipa yiya awo naa sori iwe gbigba.Fọ patapata ni igba mẹrin.

4. Fi 100μL ti biotinylated erin antibody ṣiṣẹ ojutu sinu kanga kọọkan.Bo pẹlu sealer awo.Incubate fun 1hr ni yara otutu pẹlu gbigbọn ni 500rpm.

5. Tun igbesẹ fifọ.

6. Fi 100μL ti HRP-streptavidin ṣiṣẹ ojutu sinu kanga kọọkan.Bo pẹlu sealer awo.Incubate fun 30min ni yara otutu pẹlu gbigbọn ni 500rpm.

7. Tun fifọ igbesẹ lẹẹkansi.

8. Fi 100μL ti ojutu sobusitireti TMB sinu kanga kọọkan.Bo pẹlu sealer awo.Incubate fun iṣẹju 30 ni aabo RT lati ina.Omi naa yoo di buluu nipasẹ afikun ojutu sobusitireti.

9. Fi 50μL ti ojutu idaduro sinu kanga kọọkan.Omi yoo tan ofeefee nipasẹ afikun ojutu iduro.Lẹhinna ṣiṣẹ oluka microplate ki o ṣe wiwọn ni 450nm lẹsẹkẹsẹ.

Iṣiro Awọn esi

1. Apapọ awọn iwe kika ẹda-iwe fun boṣewa kọọkan, iṣakoso, ati awọn ayẹwo ati yọkuro iwuwo iwuwo opitika aropin odo.Ṣe ìsépo boṣewa kan pẹlu gbigba lori ipo inaro (Y) ati ifọkansi dsRNA lori ipo petele (X).

2. A ṣe iṣeduro lati ṣe iṣiro naa pẹlu sọfitiwia ti o ni ibamu pẹlu kọnputa gẹgẹbi iwé curve 1.3 tabi ELISA Calc ni awoṣe 5 tabi 4 paramita ti kii ṣe laini.

Iṣẹ ṣiṣe

1. Ifamọ:

Iwọn kekere ti wiwa: ≤ 0.001pg/μL (fun UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (fun 5-OMe-UTP-dsRNA).

Iwọn kekere ti iwọn: 0.0156 pg/μL (fun UTP-, pUTP-dsRNA), 0.0312 pg/μL (fun N1-Me-pUTP-dsRNA), 0.0625 pg/μL (fun 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Itọkasi: CV ti Intra-Assay ≤10%, CV ti Inter-Assay ≤10%

3. Imularada: 80% ~ 120%

4.Linearity: 0.0156-0.5pg / μL (fun UTP-, pUTP-dsRNA) 0.0312-1pg / μL (funN1-Me-pUTP dsRNA), 0.0625-1pg / μL (fun 5-OMe-UTP-dsRNA).

Awọn ero

1. TMB iwọn otutu lenu ati akoko jẹ pataki, jọwọ ṣakoso wọn ni ibamu si itọnisọna ni muna.

2. Ni ibere lati se aseyori ti o dara assay reproducibility ati ifamọ, dara fifọ ti awọn farahan lati yọ excess un-reacted reagents jẹ pataki.

3. Gbogbo awọn reagents yẹ ki o wa ni idapo daradara ṣaaju lilo ati yago fun awọn bumbles lakoko apẹẹrẹ tabi awọn afikun awọn reagents.

4. Ti o ba ti awọn kirisita ti akoso ninu ogidi w saarin(20x), gbona si 37 ℃ ati ki o dapọ rọra titi awọn kirisita ti wa ni tituka patapata.

5. Yẹra fun ayẹwo awọn ayẹwo ti o ni Sodium Azide (NaN3) ninu, nitori o le pa iṣẹ HRP jẹ eyiti o jẹ abajade ti ko ni idiyele ti iye dsRNA.

6. Yẹra fun ibajẹ RNase lakoko ayẹwo.

7. Awọn boṣewa / ayẹwo, erin antibody ati SA-HRP le tun ti wa ni o waiye ni RT lai gbigbọn, ṣugbọn yi le fa erin ifamọ dinku nipa ọkan-agbo.Fun ọran yii, a ṣeduro UTP ati awọn iṣedede pUTP dsRNA yẹ ki o fomi ni lati 2pg/μL, awọn iṣedede N1-Me-pUTP dsRNA yẹ ki o fomi po lati 4pg/μL ati pe o yẹ ki o jẹ ti fomi 5-OMe-UTP dsRNA lati 8pg/μL.Ni afikun, incubate HRP-streptavidin ṣiṣẹ ojutu fun 60min ni yara otutu.Ma ṣe lo gbigbọn flask, nitori gbigbọn flask le ja si abajade ti ko pe.

Abajade aṣoju

1. Standard ti tẹ data

2. Standard ti tẹ isiro

3. Iwọn wiwa Liner: 0.0312- 1pg / μL