M-MLV Neoscript Yiyipada Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase jẹ iyipada iyipada ti a gba nipasẹ ṣiṣayẹwo iyipada ti jiini M-MLV ti orisun kokoro aisan lukimia Moloney murine ati ikosile ni E.coli.Enzymu yọkuro iṣẹ ṣiṣe RNase H, ni ifarada iwọn otutu ti o ga julọ, ati pe o dara fun iyipada iwọn otutu giga.Nitorinaa, o ṣe iranlọwọ fun imukuro awọn ipa ti ko dara ti igbekalẹ ipele giga RNA ati awọn ifosiwewe ti kii ṣe pato lori iṣelọpọ cDNA, ati pe o ni iduroṣinṣin ti o ga julọ ati yiyipada agbara iṣelọpọ transcription.Enzymu naa ni iduroṣinṣin ti o ga julọ ati yiyipada agbara iṣelọpọ transcription.
Awọn eroja
1.200 U/μL Neoscript Yiyipada Transcriptase
2.5 × Fipamọ Okun-akọkọ (aṣayan)
* 5 × First-Strand Buffer ko ni dNTP ninu, jọwọ ṣafikun awọn dNTP nigbati o ngbaradi eto ifaseyin
Ohun elo ti a ṣe iṣeduro
1.Ọkan-igbese qRT-PCR.
2.RNA kokoro erin.
Ibi ipamọ Ipo
-20°C fun ibi ipamọ igba pipẹ, o yẹ ki o dapọ daradara ṣaaju lilo, yago fun didi-diẹ loorekoore.
Unit Definition
Ẹyọ kan ṣafikun 1 nmol ti dTTP ni iṣẹju mẹwa 10 ni 37°C ni lilo poly(A)•oligo(dT)25bi awoṣe / alakoko.
Iṣakoso didara
1.SDS-PAGE elekitirophoretic ti nw ti o tobi ju 98%.
2.Ifamọ titobi, iṣakoso ipele-si-ipele, iduroṣinṣin.
3.Ko si iṣẹ-ṣiṣe nuclease exogenous, ko si exogenous endonuclease tabi ibajẹ exonuclease
Iṣeto Ifa fun Solusan Idahun Pq akọkọ
1.Igbaradi ti adalu lenu
| Awọn eroja | Iwọn didun |
| Oligo(dT)12-18 Alakoko tabi ID alakokoa Tabi Gene Specific alakokob | 50pml |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Àdàkọ RNA | Lapapọ RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| dH ti ko ni RNase2O | Si 10 μl |
Awọn akọsilẹ:a/b: Jọwọ yan yatọ si orisi ti alakoko gẹgẹ rẹ esiperimenta aini.
2.Ooru ni 65°C fun iṣẹju 5 ati ki o tutu ni iyara lori yinyin fun iṣẹju 2.
3.Ṣafikun awọn paati atẹle si eto ti o wa loke si iwọn lapapọ ti 20µL ki o dapọ rọra:
| Awọn eroja | Iwọn didun (μL) |
| 5 × Ifipamọ Okun akọkọ | 4 |
| Tiranscriptase Yiyipada Neoscript (200 U/μL) | 1 |
| Idalọwọduro RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH ti ko ni RNase2O | Si 20 μl |
4.Jọwọ ṣe iṣesi gẹgẹbi awọn ipo wọnyi:
(1) Ti o ba ti lo ID alakoko, awọn lenu yẹ ki o wa ni ti gbe jade ni 25 ℃ fun 10mins, ati ki o si ni 50 ℃ fun 30 ~ 60mins;
(2) Ti o ba ti lo Oligo dT tabi awọn alakoko kan pato, iṣesi yẹ ki o ṣee ṣe ni 50 ℃ fun 30 ~ 60mins.
5.Ooru ni 95 ℃ fun awọn iṣẹju 5 lati mu Neoscript Reverse Transcriptase ṣiṣẹ ati fopin si iṣesi naa.
6.Awọn ọja transcription yiyipada le ṣee lo taara ni iṣesi PCR ati iṣesi pipo PCR fluorescence, tabi fipamọ ni -20℃ fun igba pipẹ.
PCR Rigbese:
1.Igbaradi ti adalu lenu
| Awọn eroja | Ifojusi |
| 10 × PCR Buffer (ọfẹ dNTP, Mg²+ ọfẹ) | 1× |
| dNTPs (10mM dNTP kọọkan) | 200 μM |
| 25 mMgCl2 | 1-4 mm |
| Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
| Alakoko 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Alakoko 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Àdàkọa | ≤10% Solusan Idahun Pq akọkọ (2 μL) |
| ddH2O | Lati 50 milimita |
Awọn akọsilẹ:a: Ti o ba ti ju Elo akọkọ pq lenu ojutu ti wa ni afikun, awọn PCR lenu le ti wa ni dojuti.
2.Ilana Idahun PCR
| Igbesẹ | Iwọn otutu | Aago | Awọn iyipo |
| Pre-denaturation | 95℃ | 2-5 iṣẹju | 1 |
| Denaturation | 95℃ | 10-20 iṣẹju-aaya | 30-40 |
| Annealing | 50-60 ℃ | 10-30 iṣẹju-aaya | |
| Itẹsiwaju | 72℃ | 10-60 iṣẹju-aaya |
Awọn akọsilẹ
1.Dara fun iṣapeye iwọn otutu transcription yiyipada ni iwọn 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.O ni iduroṣinṣin to dara julọ, o dara fun imudara transcription yiyipada iwọn otutu giga.Ni afikun, o jẹ ọjo fun gbigbe daradara nipasẹ awọn ẹkun igbekalẹ eka ti RNA.Bakannaa, oni o dara fun ọkan-igbese multiplex fluorescence pipo RT-PCR erin.
3.Ibamu ti o dara pẹlu ọpọlọpọ awọn enzymu imudara PCR ati pe o dara fun awọn ifamọ RT-PCR giga.
4.Dara fun ifamọ giga ọkan-igbesẹ fluorescence pipo lenu RT-PCR, imunadoko ni ilọsiwaju oṣuwọn wiwa ti ifọkansi kekere ti awọn awoṣe.
5.Dara fun ikole ikawe cDNA.
