Ohun ọgbin taara PCR Kit

Nọmba ologbo: HCR2020A

Ohun elo PCR Direct Plant dara fun imudara taara ti awọn ewe ọgbin, awọn irugbin, ati bẹbẹ lọ, ati pe o le ṣee lo fun ibojuwo-giga ti awọn apẹẹrẹ ọgbin ti ko ni awọn polysaccharides ati awọn polyphenols.Imudara taara DNA polymerase ti o da lori itankalẹ itọsọna ni ifarada ti o ga julọ si awọn inhibitors PCR ninu awọn ohun ọgbin.Nibayi, o n ṣetọju iṣẹ imudara giga, eyiti o dara fun imudara ti awọn ajẹkù DNA laarin 5 kb.Ifipamọ Lysis alailẹgbẹ A ninu ohun elo le ṣee lo lati lyse tuntun tabi awọn ohun ọgbin tio tutunini.O rọrun lati ṣiṣẹ ati pe lysate le ṣee lo bi awoṣe fun imudara laisi ìwẹnumọ.Eto naa ni awọn aṣoju aabo ti o jẹ ki awọn ayẹwo robi le ni imunadoko lẹhin didi ati gbigbo leralera.2 × Plant Direct Master Mix nikan nilo lati ṣafikun awọn alakoko ati awọn awoṣe lati ṣe ifasilẹ imudara, nitorinaa idinku awọn iṣẹ pipetting ati imudara wiwa wiwa ati atunṣe awọn abajade.

Awọn eroja

* Ohun ọgbin Taara Lysis Buffer B jẹ reagent yiyan, eyiti o lo lati yomi ọgbin Taara Lysis Buffer A fun gigun akoko ibi ipamọ ti awọn ayẹwo.O le ṣee lo ni ibamu si ipo gangan.

Awọn ipo ipamọ

2 × Plant Direct Master Mix, itaja ni -30 ~ -15 ℃ ati yago fun didi ati thawing leralera;Ohun ọgbin Direct Lysis Buffer, itaja ni -30 ~ -15℃ tabi 2 ~ 8℃.

Ilana idanwo

Ṣiṣe Ayẹwo–Ewe ọgbin

Ọna taara:O ti wa ni niyanju lati lo odo leaves.Lo iho iho pẹlu iwọn ila opin ti 0.5 - 3 mm lati gba iwọn kekere ati aṣọ-aṣọ, ati lẹhinna ṣafikun apẹẹrẹ taara si eto PCR (a ṣe iṣeduro eto 50 μl).Akiyesi, rii daju pe ayẹwo wa ni ojutu PCR kii ṣe lodi si ogiri tube.Ti a ba lo PCR taara lati ṣe alekun awọn ajẹkù gigun ati awọn ayẹwo idiju, lilo apẹẹrẹ pẹlu iwọn ila opin kekere kan (0.5 – 1 mm) bi awoṣe le ṣe iranlọwọ lati gba awọn abajade to dara julọ.

Ọna lilọ:O ti wa ni niyanju lati lo odo leaves.Mu ewe kekere kan (nipa 1 - 3 mm ni iwọn ila opin), gbe si 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, ki o lọ bi o ti ṣee ṣe (igbesẹ yii le ṣee ṣe nipa titẹ ewe naa pẹlu 100 μl pipette sample. lati mash ayẹwo).Ti o ba ti lo awọn iwọn nla ti àsopọ ewe (ko kọja 7 mm), mu iwọn didun ti ifimimi dilution pọ si 50 μl.Lẹhin ti awọn leaves ti wa ni ilẹ, ojutu yẹ ki o han alawọ ewe.Lẹhin centrifugation finifini, ṣafikun 1 μl ti supernatant si eto PCR bi awoṣe ifaseyin.

Ọna lysis thermal:O ti wa ni niyanju lati lo odo leaves.Mu ewe kekere kan (nipa 1 - 3 mm ni iwọn ila opin), gbe si 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, ki o si gbona ni 95 ° C fun 5 - 10 min.Akoko lysis le faagun ni deede fun awọn ewe ti o nira lati lyse (ko ju iṣẹju 20 lọ).Ti o ba ti lo awọn iwọn nla ti àsopọ ewe (ko kọja 7 mm), mu iwọn didun ti ifimimi dilution pọ si 50 μl.Lẹhin alapapo, centrifuge ni ṣoki, ati ṣafikun 1 μl ti supernatant si eto PCR gẹgẹbi awoṣe ifasẹyin.

Ṣiṣe Ayẹwo– Irugbin ọgbin

Ọna lilọ:Lo pepeli lati ge awọn irugbin pẹlu iwọn ila opin ti 5 mm, fi wọn kun si 100 μl ti Plant Direct Lysis Buffer A, ki o si lọ awọn ayẹwo pẹlu ipari pipette tabi awọn irinṣẹ miiran.Vortex ni ṣoki ki o jẹ ki o duro ni iwọn otutu yara fun awọn iṣẹju 3 - 5.Rii daju pe awọn ayẹwo irugbin ti wa ni submerged ni ifimi fomi.Lẹhin centrifugation finifini, ṣafikun 1 μl ti supernatant si eto PCR bi awoṣe ifaseyin.

Ọna lysis thermal:Lo pepeli lati ge awọn irugbin pẹlu iwọn ila opin ti 5 mm, fi wọn kun si 100 μl ti Plant Direct Lysis Buffer A, ati ooru ni 95 ° C fun 5 - 10 min.Akoko lysis le faagun ni deede fun awọn ewe ti o nira lati lyse (ko si ju awọn iṣẹju 30 lọ).Lẹhin alapapo, centrifuge ni ṣoki, ati ṣafikun 1 μl supernatant si eto PCR gẹgẹbi awoṣe ifasẹyin.

a.Scissors tabi awọn irinṣẹ miiran le tun ṣee lo lati ge awọn ayẹwo ti iwọn to dara;ti a ba tun lo punch tabi scissors, wọn yẹ ki o di mimọ pẹlu 2% iṣuu soda hypochlorite ojutu ṣaaju lilo kọọkan lati yago fun kontaminesonu laarin awọn ayẹwo.

b.Rii daju pe Ohun ọgbin Taara Lysis Buffer ti yo ni kikun ṣaaju lilo.Ti ifipamọ ba jẹ viscous tabi ni awọn itọlẹ, o le jẹ kikan ni 37℃ lati yo patapata ṣaaju lilo.

c.Iwọn ti awoṣe ninu eto ifaseyin le ṣe atunṣe ni deede ni ibamu si iyatọ ninu iwọn didun ohun elo ọgbin ati fikun diluent.

Ohun ọgbin Dari Lysis saarin

Ohun ọgbin Taara Lysis Buffer A ti o wa ninu ọja yii ti ni iṣapeye ni muna lati tusilẹ jiini ti ọpọlọpọ awọn sẹẹli ọgbin ati pe o dara fun ibi ipamọ igba kukuru ti awọn irugbin robi ni 4℃.Ti ayẹwo ba nilo lati wa ni ipamọ fun igba pipẹ (fun apẹẹrẹ, awọn oṣu 1-2), o niyanju lati gbe supernatant lọ si tube EP tuntun kan ki o tọju ni -20℃.Lati tọju awọn ayẹwo diẹ sii ni iduroṣinṣin, ṣafikun iwọn dogba ti Plant Direct Lysis Buffer B si supernatant ti o gbe, dapọ daradara ati tọju ni -20℃.Akoko ipamọ iduroṣinṣin yatọ pẹlu awọn apẹẹrẹ ọgbin ati awọn ipinlẹ.

ifaseyin System

a.O ni Mg²⁺ni ifọkansi ikẹhin ti 2 mM.

b.A ṣe iṣeduro lati lo ifọkansi ikẹhin ti 0.4μM fun alakoko kọọkan.Lilo awọn alakoko lọpọlọpọ yoo ja si alekun ti kii ṣe pataki.

c.Iwọn ayẹwo ti a lo le ṣe atunṣe ni ibamu si ipo gangan.Awọn iye ti a lo ni kan nikan lenu ti robi lysed ayẹwo le ti wa ni titunse laarin 2% – 20% ti lapapọ iwọn didun ti awọn lenu.Lilo awọn ayẹwo pupọ le fa ikuna imudara.

Eto ifaseyin

a.Denaturation akọkọ (98 ℃, 5 min) ṣe igbega lysis ti àsopọ ọgbin, idasilẹ DNA jiini ti o le ṣee lo fun imudara PCR.Ma ṣe kuru akoko tabi dinku iwọn otutu.

b.A gba ọ niyanju lati ṣeto dogba si iye alakoko Tm tabi 2 ~ 4℃ ti o ga ju iye Tm lọ.Imudara taara DNA polymerase ti a lo ninu ọja yii yatọ si Taq DNA polymerase ti aṣa, ati pe o ni awọn ibeere pataki fun iwọn otutu annealing ifaseyin; lilo iwọn otutu annealing giga le dinku imunadoko pato ati ilọsiwaju imudara imudara.Fun awọn awoṣe ti o nipọn, imudara daradara le ṣee ṣe nipasẹ ṣiṣatunṣe iwọn otutu annealing ati gigun akoko itẹsiwaju.

c.Ti ipari ọja imudara jẹ ≤1 kb, akoko itẹsiwaju ti ṣeto ni 30 sec / kb;ti ipari ọja imudara ba jẹ> 1 kb, akoko itẹsiwaju ti ṣeto ni 60 iṣẹju-aaya / kb.

d.Fun awọn ayẹwo idiju tabi awọn ayẹwo pẹlu ikore ampilifaya kekere, nọmba awọn iyipo le pọsi ni deede si awọn akoko 40 -50.

Awọn ohun elo

O wulo fun imudara taara ti awọn sẹẹli ọgbin ati ibojuwo-giga ti awọn ayẹwo ọgbin ti ko ni awọn polysaccharides ati awọn polyphenols.

Awọn akọsilẹ

Fun iwadi nikan lo.Kii ṣe fun lilo ninu awọn ilana iwadii aisan.

1. Fun amúṣantóbi ti ọgbin robi tabi taara ampilifaya, o ti wa ni niyanju lati lo ìwẹnumọ genomic DNA bi a rere Iṣakoso ṣaaju ki o to bẹrẹ awọn ṣàdánwò lati rii daju wipe awọn eto, awọn alakoko ati awọn iṣẹ ni o tọ.

2. Imudara taara DNA polymerase ti a lo ninu ohun elo yii ni iṣẹ ṣiṣe iṣatunṣe to lagbara.Ti cloning TA nilo lati ṣe, o niyanju lati sọ DNA di mimọ ṣaaju fifi adenine kun.

3. Itọsọna Apẹrẹ akọkọ:

a.A ṣe iṣeduro pe ipilẹ ti o kẹhin ni opin 3′ ti alakoko yẹ ki o jẹ G tabi C.

b.Awọn aiṣedeede itẹlera yẹ ki o yago fun ni awọn ipilẹ 8 kẹhin ni 3′ opin alakoko.c.Yago fun awọn ẹya irun ni opin 3′ ti alakoko.

d.Awọn iyatọ ninu iye Tm ti alakoko iwaju ati alakoko yiyipada ko yẹ ki o jẹ diẹ sii ju 1 ℃ ati pe iye Tm yẹ ki o ṣatunṣe si 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 ni a ṣe iṣeduro lati ṣe iṣiro iye Tm).

e.Awọn ilana alakoko afikun afikun ti ko baamu pẹlu awoṣe, ko yẹ ki o wa pẹlu iṣiro iye alakoko Tm.

f.A ṣe iṣeduro pe akoonu GC ti alakoko lati jẹ 40% -60%.

g.Pipin apapọ ti A, G, C ati T ni alakoko yẹ ki o jẹ paapaa bi o ti ṣee ṣe.Yago fun lilo awọn agbegbe pẹlu GC giga tabi akoonu AT.

h.Yago fun wiwa awọn ilana ibaramu ti 5 tabi awọn ipilẹ diẹ sii boya laarin alakoko tabi laarin awọn alakoko meji ki o yago fun wiwa awọn ilana ibaramu ti 3 tabi awọn ipilẹ diẹ sii ni 3′ opin awọn alakoko meji.

i.Lo iṣẹ NCBI BLAST lati ṣayẹwo pato ti alakoko lati ṣe idiwọ imudara ti kii ṣe pato.