EndoFree Plasmid Maxi Apo

Awọn ipo ipamọ

RNaseA yẹ ki o wa ni ipamọ ni -30 ~ -15 ℃ ati gbigbe ni ≤0℃.

Endotoxin Scavenger le wa ni ipamọ ni 2 ~ 8 ℃ fun oṣu kan, ti o fipamọ ni -30 ~ -15 ℃ fun ibi ipamọ igba pipẹati gbigbe ni ≤0℃.

Awọn paati miiran yẹ ki o wa ni ipamọ ni iwọn otutu yara (15 ~ 25 ℃) ati gbigbe ni iwọn otutu yara.

Awọn eroja

RNaseA:10 mg / milimita, ti a lo lati yọ RNA kuro.

Ifipamọ P1:saarin idadoro kokoro-arun, ṣafikun RNaseA si Buffer P1 ṣaaju lilo akọkọ.

Idaduro P2:saarin lysis kokoro-arun (ti o ni SDS/NaOH ninu).

Idaduro P4:didoju saarin.

Scavenger Endotoxin:ni imunadoko yọ endotoxin kuro lati inu plasmid robi jade.

Idaduro PW:fifọ fifọ, ṣafikun iwọn didun ethanol ṣaaju lilo akọkọ.

TB ifipamọ:saarin elution.

FastPure DNA Maxi Awọn ọwọn:awọn ọwọn adsorption DNA plasmid.

Awọn tubes gbigba 50 milimita:filtrate gbigba Falopiani.

Tube Gbigba ti ko ni Endotoxin:awọn tubes gbigba DNA plasmid.

Awọn ohun elo ti a ti pese sile

Ethanol pipe, isopropanol, 50 milimita awọn tubes centrifuge-isalẹ ati 50 milimita endotoxin-ọfẹcentrifuge ọpọn.

Awọn ohun elo

Ọja yii dara fun isediwon titobi nla ti plasmids lati 150 - 300 milimita ti ojutu kokoro-arun.gbin moju.

Ilana idanwo

1. Mu 150 - 200 milimita (ko si ju 300 milimita) ti ojutu kokoro-arun ti a gbin ni alẹ ati centrifuge ninipa 11,000 rpm (12,000 × g) fun 1 - 2 min.Jabọ supernatant ati ki o gba kokoro arun.

∆ Nigbati o ba n gba diẹ sii ju 50 milimita ti ojutu kokoro-arun, a le gba awọn kokoro arun nipa fifi ojutu kokoro-arun kun, centrifugation, sisọnu supernatant ati awọn igbesẹ miiran ni tube 50 milimita kanna fun

ọpọ igba.

2. Fi 7.5 milimita ti Buffer P1 kun (jọwọ ṣayẹwo boya RNaseA ti fi kun si Buffer P1) si centrifugetube ti o ni kokoro arun ati ki o dapọ daradara nipasẹ vortex tabi pipetting.

∆ Idaduro pipe ti awọn kokoro arun ni igbesẹ yii jẹ pataki lati so eso, ati pe ko yẹ ki o jẹ awọn iṣupọ kokoro lẹhin ifasilẹ.Ti o ba ti wa ni kokoro arun clumps ti o ko ba wa ni daradara adalu, o yoo ni ipa awọn lysis, Abajade ni kekere ikore ati ti nw.Ti OD600 ti ojutu kokoro-arun jẹ 0.65, a ṣe iṣeduro pe 7.5 milimita ti Buffer P1 ṣee lo nigbati o ba n jade lati 150 milimita ti ojutu kokoro-arun;nigbati OD600 jẹ 0.75, 8 milimita ti Buffer P1 yẹ ki o lo ati awọn iwọn didun ti Buffers P2 ati P4 yẹ ki o yipada ni ibamu.Ti o ba ti awọn iwọn didun ti awọn kokoro ojutu ti wa ni pọ si 200 milimita, o ti wa ni niyanju wipe awọnIwọn Buffers P1, P2, ati P4 jẹ alekun ni iwọn.

3. Fi 7.5 milimita ti Buffer P2 kun si idaduro kokoro-arun lati igbesẹ 2 ki o si dapọ rọra si oke ati isalẹ fun 6 - 8awọn akoko ati incubate ni iwọn otutu yara fun awọn iṣẹju 4-5.

Δ Yipada rọra lati dapọ daradara.Vortexing yoo fa jiini DNA Fragmentation, Abajade ni genomic DNA ajẹkù ninu awọn plasmid jade.Ni akoko yii, ojutu naa di viscous ati translucent, ti o fihan pe awọn kokoro arun ti ni kikun lysed.Iye akoko ko yẹ ki o kọja iṣẹju 5 lati yago fun iparun ti awọn plasmids.Ti ojutu naa ko ba han, o le jẹ ọpọlọpọ awọn kokoro arun ti o yọrisilysis ti ko pari, nitorinaa iye awọn kokoro arun yẹ ki o dinku ni deede.

4. Fi 7.5 milimita ti Buffer P4 kun si idaduro kokoro-arun lati igbesẹ 3 ati lẹsẹkẹsẹ yi pada ni rọra ni awọn akoko 6 – 8 lati gba ojutu laaye lati yọkuro Buffer P2 patapata.Ni akoko yii, ojoro flocculent funfun yẹ ki o han.Centrifuge ni diẹ sii ju 11,000 rpm (12,000 × g) fun iṣẹju 10 – 15, farabalẹ pippette awọn supernatant sinu tube centrifuge tuntun 50 milimita (ti a murasilẹ funrarẹ), ati yago funaspirate awọn lilefoofo funfun precipitate.

Δ Ṣafikun Buffer P4 ati yipada lẹsẹkẹsẹ lati dapọ daradara.Fi tube silẹ lati duro titi ti ojoriro funfun yoo pin ni deede jakejado ojutu lati ṣe idiwọ iṣelọpọ ti ojoriro agbegbe eyiti o le ni ipa lori didoju.Ti ko ba si aṣọ asọ funfun flocculent precipitate ṣaaju ki o to centrifugation ati awọn supernatant ni ko ko o lẹhin centrifugation, tube le jẹ.centrifuged fun miiran 5 min.

5. Ṣafikun 0. 1 igba iwọn didun (10% ti iwọn didun agbara, nipa 2.2 milimita) ti Endotoxin Scavenger si supernatant lati igbesẹ 4 ki o yipada lati dapọ.Fi ojutu naa sinu iwẹ yinyin tabi fi sii sinu yinyin ti a fọ ​​(tabi firisa firiji) fun iṣẹju 5 titi ti ojutu yoo yipada lati turbid lati ko o ati sihin (tabi tunturbid die-die), ati lẹẹkọọkan dapọ ni igba pupọ.

∆ Lẹhin ti Endotoxin Scavenger ti wa ni afikun si supernatant, supernatant yoo di turbid ṣugbọn awọnsupernatant yẹ ki o di mimọ (tabi turbid die-die) lẹhin itutu agbaiye ninu iwẹ yinyin.

6. Lẹhin ti supernatant ti wa ni gbe ni yara otutu (> 25 ℃) fun 10 - 15 min, o yoo di turbid biiwọn otutu rẹ pọ si iwọn otutu yara.Lẹhinna o yẹ ki o yipada alaṣẹ lati dapọ.

∆ Ti iwọn otutu yara ba dinku tabi o fẹ lati dinku akoko isediwon, a le fi omi ṣan omi ni iwọn otutu 37 ~ 42 ℃ fun iṣẹju 5-10 ati pe igbesẹ ti n tẹle le ṣee ṣe lẹhin supernatant.di turbid.

7. Centrifuge awọn supernatant ni nipa 11,000 rpm (12,000 × g) fun 10 min ni yara otutu (iwọn otutu gbọdọ jẹ> 25 ℃) lati ya awọn alakoso.Ipele olomi oke ni DNA lakoko ti ipele ipele olomi buluu isalẹ ni endotoxin ati awọn aimọ miiran.Gbe awọnDNA-ti o ni awọn olomi alakoso si titun kan tube atidanu awọn oily Layer.

Δ Iwọn otutu lakoko centrifugation gbọdọ jẹ lori 25 ℃ bi ipinya alakoso ti o munadoko ko ṣewaye ti iwọn otutu ba kere ju.

Δ Ti ipinya alakoso ko ba munadoko, iwọn otutu centrifugation le ṣe atunṣe si 30 ℃ atiakoko ti centrifugation le ti wa ni pọ si 15 min.

ΔMaṣe fa awọ awọ buluu oloro bi o ti ni endotoxin ati awọn aimọ miiran.

Ilana

Idaduro Lysis Neutralization

Fi 7.5 milimita Buffer P1 kun

Fi 7.5 milimita Buffer P2 kun

Fi 7.5 milimita Buffer P4 kun

Imukuro Endotoxin

◇ Ṣafikun 0. 1 iwọn didun ti o ga julọ ti Scavenger Endotoxin

Asopọmọra ati Fifọ

◇ Ṣafikun awọn akoko 0.5 iwọn didun isopropanol

◇ Fi 10 milimita Buffer PW kun