Uracil DNA Glycosylase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG tabi UDG) jẹ ẹda oniye ti E.coli pẹlu iwuwo molikula kan ti 25 kDa.O ṣe itusilẹ ti uracil ọfẹ lati inu uracil ti o ni ẹyọkan ati DNA ti o ni ilopo meji, ati pe ko ṣiṣẹ ni ilodi si RNA, ati pe o le ṣee lo lati yago fun idoti ti awọn ọja imudara PCR.Ilana ti iṣe da lori otitọ pe ti dUTP ba rọpo fun dTTP ninu iṣesi PCR ati pe ọja imudara PCR kan ti o ni awọn ipilẹ dU ti ṣẹda, enzymu le yan adehun adehun glycosidic ti awọn ipilẹ U ni okun-ẹyọkan ati ilopo-meji. DNA ati degrade awọn PCR ampilifaya ọja.
Ohun elo ti a ṣe iṣeduro
Idena Idena Idoti
Ibi ipamọ Ipo
-20°C fun ibi ipamọ igba pipẹ, o yẹ ki o dapọ daradara ṣaaju lilo, yago fun didi-diẹ loorekoore.
Ifipamọ ipamọ
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilizer, 50% Glycerol.
Unit Definition
Iye henensiamu ti a beere lati dinku 1µg ti DNA ti o ni okun-ẹyọkan ti o ni awọn ipilẹ dU ninu wakati 1 ni 37°C jẹ ẹyọ 1.
Iṣakoso didara
1.SDS-PAGE mimọ elekitirotiki ti o tobi ju 98%
2.Ifamọ titobi, iṣakoso ipele-si-ipele, iduroṣinṣin
3.Lẹhin itọju 1U ti UNG ni 50℃ fun iṣẹju meji, awoṣe ti o ni U ni isalẹ awọn ẹda 103 yẹ ki o bajẹ patapata ati pe ko si ọja imudara ti o le ṣejade
4.Ko si exogenous nuclease aṣayan iṣẹ-ṣiṣe
Awọn ilana
| Awọn eroja | Iwọn didun (μL) | Ifojusi ikẹhin |
| 10 × PCR Buffer (ọfẹ dNTP, Mg²+ofe) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (rọpo dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mMgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mm |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0.25 U (0.1-0.5) |
| 25 × Alakoko Mixa | 2 | 1× |
| Àdàkọ | - | 1 μg / esi |
| ddH₂O | Si 50 | - |
Akiyesi: a: Ti o ba ti lo fun qPCR/qRT-PCR, awọn Fuluorisenti ibere yẹ ki o wa ni afikun si awọn lenu eto.Nigbagbogbo, ifọkansi alakoko ikẹhin ti 0.2 μM le fun awọn abajade to dara;nigbati iṣẹ iṣe iṣe ko dara, ifọkansi alakoko le ṣe atunṣe ni iwọn 0.2-1 μM.Nigbagbogbo, ifọkansi iwadii jẹ iṣapeye ni iwọn 0.1-0.3 μM.Awọn adanwo gradient ifọkansi le ṣee ṣe lati wa apapọ ti o dara julọ ti alakoko ati iwadii.
Awọn akọsilẹ
1.Enzymu UNG le ṣee lo lati yọkuro awọn ọja imudara dUTP ti a ti doti lati eto ifaṣaaju idasi imudara PCR, lẹhinna lati yago fun awọn abajade rere-eke nitori ibajẹ ọja.
2.Iwọn otutu ti o dara julọ fun enzymu UNG lati ṣee lo ninu iṣesi PCR anti-kontaminesonu jẹ 50℃ ni gbogbogbo fun awọn iṣẹju 2;ipo aiṣiṣẹ jẹ 95 ℃ fun iṣẹju 5.
3.Yago fun didi-diẹ loorekoore, ati ma ṣe fi han si awọn iyipada iwọn otutu nla.
4.Awọn Jiini ti o yatọ lati ṣe alekun ni iṣẹ ṣiṣe lilo oriṣiriṣi ti dUTP ati ifamọ si enzymu UNG, nitorinaa, ti lilo eto UNG ba yori si idinku ninu ifamọ wiwa, eto ifarabalẹ yẹ ki o ṣatunṣe ati iṣapeye, ti o ba nilo atilẹyin imọ-ẹrọ, jọwọ kan si ile-iṣẹ wa.
